【综述】缺血性卒中后应激颗粒动态相变机制及其对神经元的影响

缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是由脑血管栓塞或动脉粥样硬化性血管狭窄引发,导致大脑血液和氧气供应减少或中断的急性脑血管疾病｡IS发生后,神经元在缺氧状态下出现急性应激反应,进而触发应激颗粒的快速组装｡应激颗粒是由核糖核酸结合蛋白(ribonucleic acid binding protein,RBP)和核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子通过低复杂性结构域发生液-液相分离形成的无膜细胞器｡既往研究表明,应激颗粒与神经系统疾病(如IS､肌萎缩侧索硬化症)的发生发展关系密切｡笔者对IS后应激颗粒的动态相变机制及其对神经元的具体影响进行了综述,以期为揭示IS发病机制,探寻潜在治疗靶点提供理论依据和新思路｡

IS发生后,脑血流的局灶性受阻导致其对氧和葡萄糖的运输受限,脑组织依赖氧化磷酸化获取能量,但IS后腺苷三磷酸合成减少,钠-钾泵因缺乏能量而失效,细胞膜发生去极化,Ca²⁺通道被激活,过量的谷氨酸被释放,大量的Ca²⁺通过被激活的N-甲基-D-天冬氨酸受体进入神经元,而Ca²⁺超载与神经元的凋亡密切相关｡内质网是细胞内调节Ca²⁺水平的关键细胞器,Ca²⁺水平紊乱可导致未折叠或错误折叠的蛋白质累积在内质网内,引起内质网应激｡为应对内质网应激,未折叠蛋白反应发生,蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)诱导真核翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)磷酸化,破坏具有翻译能力的eIF2α-鸟苷三磷酸-起始甲硫氨酰转运RNA三元复合物,导致翻译起始停滞,蛋白质合成抑制,内质网上未折叠蛋白质的负荷减少｡翻译受到阻滞的预起始复合物､信使RNA(messenger RNA,mRNA)和翻译起始因子(如eIF4A､eIF4G)通过低复杂性结构域之间动态且多样的相互作用力驱动液-液相分离,继而组装形成应激颗粒｡在缺氧和能量衰竭的条件下,应激颗粒还可以通过eIF4E结合蛋白1的去磷酸化诱导形成｡RBP通过多价相互作用调控应激颗粒的时空动态组装,其典型代表T细胞胞内抗原1(T-cell intracellular antigen 1,TIA1)和大鼠肉瘤病毒鸟苷三磷酸激活蛋白结合蛋白1(rat sarcoma virus guanosine triphosphate-activating protein-binding protein,G3BP1)可与未翻译mRNA､翻译起始因子及预起始复合物发生特异性相互作用｡应激颗粒核心RBP(TIA1､G3BP1等)可以作为支架蛋白通过结合停滞的转录本驱动液-液相分离,形成具有可逆寡聚化能力的应激颗粒核心｡应激颗粒的形成遵循层级组装模式,初级的RBP-RNA凝聚体通过异型相互作用招募含不同RBP的次级凝聚体,最终形成具有核心-壳层结构的亚稳态应激颗粒｡这种动态结构可塑性使应激颗粒在应激条件下实现快速组装,并在应激消退后迅速解聚｡在氧化应激的恢复过程中,三基序蛋白21催化G3BP1泛素化,并与自噬受体相互作用介导应激颗粒消除｡

研究表明,在IS再灌注后超早期(6~36h),应激颗粒可以抑制细胞凋亡,对神经元发挥保护作用｡在雄性SD大鼠大脑中动脉闭塞-再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)模型中,采用免疫组化染色和TUNEL检测法对脑组织中应激颗粒存在的标志物TIA1的表达和神经元凋亡水平进行检测,结果显示,神经元凋亡水平在再灌注后6h最低,再灌注后24h达到峰值,再灌注后36h仍下降;而TIA1的表达在再灌注后6h最高,再灌注后24h生成逐渐减少,再灌注36h后再升高,表明应激颗粒形成可能与神经元凋亡水平成反比趋势,应激颗粒可抑制神经元凋亡｡应激颗粒在IS后神经元急性应激反应中可能通过以下机制发挥抗凋亡作用:(1)应激颗粒可封存翻译停滞的mRNA-核糖体复合物,避免其被RNA降解酶识别和降解,维持翻译延伸过程的持续性｡TIA1可以通过低复杂性结构域与mRNA结合,形成液态凝聚体,对mRNA的稳定性起到调控作用｡同时,参与应激颗粒形成的转录本被允许持续性翻译,维持细胞基本的代谢和功能,其中激活转录因子4和热休克蛋白70有助于减少蛋白质表达过程中的错误折叠,从而维持细胞内蛋白质稳态,减少细胞因蛋白质错误折叠积累而引发的凋亡,增强细胞对应激的耐受能力｡(2)应激颗粒通过液-液相分离形成的液态凝聚体可特异性捕获促凋亡因子及死亡受体信号分子,阻断凋亡级联反应的启动,为细胞修复争取时间窗口｡这种转录后调控策略具有重要意义,其避免了在全局性翻译抑制下参与细胞正常生理代谢过程的关键酶类合成受限,同时还可通过选择性mRNA隔离实现对神经元的精准调控｡

应激颗粒在IS再灌注后超早期通过液-液相分离形成动态的液态凝聚体,参与细胞应激反应｡IS再灌注后急性期,闭塞血管重新恢复血流可产生大量自由基,进而发生炎症反应,损伤血管内皮细胞和神经元,导致再灌注损伤｡在上述慢性应激条件下,细胞内液-液相分离调控网络逐渐失调,病理性应激颗粒通过液-固相变产生,原有的“液滴”状态逐渐失去动态性,转变为“凝胶”状态,并持续累积而不解聚,最终转变为病理性包涵体｡目前,关于IS再灌注后急性期应激颗粒形成机制的研究相对匮乏,参考慢性应激条件下应激颗粒在神经系统疾病中液-固相变分子机制的相关研究,其病理触发因素可能涉及以下5个方面｡(1)慢性应激状态:慢性的氧化应激条件可增强应激颗粒核心RBP液-固相变的倾向,导致其异常聚集并破坏应激颗粒的动态平衡｡(2)RBP的致病性突变:TIA1突变会导致转录激活反应脱氧RNA结合蛋白43(transactive response deoxyribonucleic acid binding protein-43,TDP-43)的流动性和不溶性降低,延迟应激颗粒的分解,并促进携带TDP-43的非动态应激颗粒积累｡(3)RBP的异常修饰:应激颗粒相关RBP[如TDP-43､融合肉瘤蛋白(fused in sarcoma,FUS)､G3BP1]的异常磷酸化､乙酰化和泛素化修饰可通过改变蛋白表面电荷分布和分子间相互作用力,导致应激颗粒向不可逆固态聚集体转化｡FUS在热应激时被小泛素样修饰蛋白依赖性核E3泛素连接酶环指蛋白4所修饰,促使FUS突变体被应激颗粒募集并滞留,阻碍应激颗粒解聚｡(4)低复杂性结构域的异常突变:低复杂性结构域突变可导致应激颗粒组装或分解的性质发生变化,使其从“液滴”状态转变至“凝胶”状态｡(5)分子伴侣的功能异常:在缺血､缺氧条件下,腺苷三磷酸的供应下降,热休克蛋白70家族等分子伴侣出现活性缺失或功能异常,导致应激颗粒各组分之间的流动性降低｡此外,含缬酪肽蛋白与泛素化蛋白质相互作用,促进其从膜结构或蛋白质复合物中被提取,进而实现降解或回收,以此调节应激颗粒动态平衡､自噬体成熟等多种细胞过程｡含缬酪肽蛋白基因突变可导致细胞自噬途径功能障碍和病理性应激颗粒持续形成｡

IS再灌注后急性期,病理性应激颗粒主要通过病理性包涵体和异常状态下的RBP引发神经元功能障碍｡病理性应激颗粒持续或重复性组装与积累使其进一步演变为具有细胞毒性的病理性包涵体,并通过物理性隔离翻译起始因子和重要mRNA引发全局性蛋白质合成抑制效应｡RBP(如TDP-43和FUS)具有介导病理性蛋白质聚集的朊病毒样结构域,其核质转运在病理条件下呈现失调特征｡在持续性应激条件下,TDP-43被诱导发生液-液相分离,形成持久的液态凝聚物｡与此同时,磷酸化的TDP-43溶解度降低,促使其迅速聚集并成为“凝胶”状固态结构｡这一相变过程可抑制核质转运机制,使TDP-43持续滞留于细胞质中,最终导致细胞核内TDP-43逐渐耗竭并触发细胞死亡级联反应｡在缺氧应激状态下,细胞质中的FUS与应激颗粒中的小细胞外囊泡标志蛋白分化簇36形成聚集体,并将功能性细胞质环状RNA募集至应激颗粒内部,随后FUS逐渐形成细胞质包涵体,并在细胞质应激颗粒内隔离游离的FUS,破坏其在RNA加工中的生理功能｡异常聚集的TDP-43或FUS可通过竞争性抑制机制干扰编码抗凋亡因子及增殖因子的RNA定位,破坏应激颗粒介导的RNA稳态调控网络,这种分子失衡可直接抑制与神经元存活和修复相关的mRNA翻译过程,最终导致神经元功能障碍及死亡｡

近年来,基于应激颗粒关键RBP开发的小分子化合物对IS再灌注后超早期抗神经元凋亡的作用逐渐受到重视｡Si等将PC12细胞体外模型氧糖剥夺-再灌注(oxygen - glucose deprivation/ reperfusion, OGD/R)6h后,进行细胞免疫荧光测定和免疫共沉淀测定,结果显示,OGD/R组RNA结合蛋白基序3(RNA binding protein motif3,RBM3)和G3BP1之间的结合率较对照组(未经处理的PC12细胞)增加79.9%(P<0.01);通过CRISPR/Cas9基因编辑系统将PC12细胞中的RBM3基因敲低,并通过转染过表达质粒在PC12细胞中实现RBM3过表达,采用TIA1和G3BP1双标记免疫荧光实验观察OGD/R 6h RBM3过表达细胞和RBM3基因敲低细胞中应激颗粒的形成情况,结果显示,与对照组(未经处理的PC12细胞)相比,RBM3过表达组中应激颗粒的形成率增加(71.16%比46.17%, P<0.01),RBM3基因敲低组中应激颗粒的形成率降低(19.40%比47.47%,P<0.01),表明RBM3可能通过与G3BP1结合促进应激颗粒的形成,从而增强PC12细胞在OGD/R应激下的抗凋亡能力｡此外,有研究显示,左旋樟脑可以上调RBM3的表达,提高微小RNA355前体的甲基化水平,调节TIA1的磷酸化水平,从而促进应激颗粒产生,降低神经元凋亡水平,实现对IS后的神经保护作用｡陈畅将荷叶碱溶于0.5%的羧甲基纤维素钠中,在SD大鼠MCAO前30min分别给予荷叶碱10､20､40mg/kg进行灌胃,灌胃体积为10ml/kg,并于MCAO后24h通过Zea Longa评分评价大鼠的神经功能,结果显示,与对照组(给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠)相比,给予10､20､40mg/kg的荷叶碱可不同程度地改善大鼠神经功能(P<0.05);采用分子对接､细胞热转变分析技术､药物亲和反应靶点稳定性技术及生物膜干涉技术对荷叶碱与G3BP1的结合能力进行观察,结果显示,荷叶碱与G3BP1的结合能力较低,且可抑制加热和酶解导致的G3BP1蛋白降解,其对G3BP1蛋白全长及其核转运因子2结构域均有良好的结合能力;采用干扰小RNA技术抑制G3BP1的表达后,荷叶碱的神经元保护作用被抑制(P<0.05),表明荷叶碱或可通过靶向G3BP1介导应激颗粒对IS发挥神经保护作用｡Sun等以SD大鼠构建MCAO/R模型,并将麝香酮溶于等渗盐水中,通过尾静脉向低､高剂量组分别注射3､9mg/kg麝香酮,采用TUNEL染色和蛋白质印迹法检测缺血皮质细胞凋亡水平,结果显示,与对照组(给予等体积等渗盐水)相比,9mg/kg麝香酮降低了MCAO/R大鼠缺血皮质的细胞凋亡水平(P<0.05);在PC12细胞构建的OGD/R体外模型中,OGD6h后,分别用含有麝香酮100､300μg/L的培养基对PC12细胞进行24h再灌注,随后采用蛋白质印迹法检测TIA1的表达水平,结果显示,OGD/R组TIA1的蛋白表达水平较对照组(未经处理的PC12细胞)降低(P<0.01),而给予100､300μg/L麝香酮的PC12细胞组TIA1的表达水平均较对照组增高(均P<0.05);经RNA干扰实验使TIA1表达沉默后,流式细胞术和免疫荧光实验结果显示,TIA1表达沉默组较对照组(未经处理的PC12细胞)应激颗粒的形成减少,细胞凋亡水平增加(均P<0.01);TIA1过表达处理后,流式细胞术和免疫荧光实验显示,TIA1过表达组较对照组(未经处理的PC12细胞)应激颗粒形成增加,细胞凋亡水平降低(均P<0.01)｡由此可见,麝香酮可与TIA1结合并调节其表达水平,从而促进应激颗粒形成,抑制细胞的凋亡,发挥神经元保护作用｡Becker等将脊髓小脑性共济失调蛋白2基因敲除小鼠与TDP-43转基因小鼠进行杂交,杂交后代小鼠脊髓小脑性共济失调蛋白2水平降低,TDP-43聚集减少,生存期延长,运动功能改善;研究人员将靶向脊髓小脑性共济失调蛋白2的反义寡核苷酸注入TDP-43转基因小鼠脑脊液中,检测其基因表达并观察其生存期和运动功能,分析TDP-43病理改变,结果显示,反义寡核苷酸组较给予等渗盐水的对照组小鼠脊髓小脑性共济失调蛋白2mRNA水平降低,小鼠寿命延长,运动功能改善,TDP-43聚集减少(均P<0.05)｡

PERK诱导eIF2α的磷酸化是启动应激颗粒形成的关键步骤｡在阿尔茨海默病､帕金森病､肌萎缩侧索硬化症､亨廷顿病､进行性核上性麻痹等神经退行性疾病临床患者的尸检大脑和脑脊液中均观察到由PERK诱导的eIF2α磷酸化｡在慢性缺氧条件下,未折叠蛋白反应发生,PERK诱导eIF2α磷酸化,神经退行性疾病主要标志物的错误折叠蛋白(如α突触核蛋白)通过液-固相变产生,并引发神经元功能障碍｡在IS再灌注急性期,神经元内同样存在病理性应激颗粒液-固相变的病理现象,且与eIF2α磷酸化通路的异常激活紧密相关｡鉴于在神经退行性疾病研究中对eIF2α磷酸化通路的认识,通过精准靶向eIF2α磷酸化通路,有望调控应激颗粒的形成过程,减少IS后病理性应激颗粒的产生｡Kim等应用浓度为10μmol/L的PERK抑制剂培养基喂养表达TDP-43的果蝇12d,通过免疫印迹法检测果蝇头部eIF2α磷酸化水平,并采用成年攀爬实验观察果蝇在一定时间内的攀爬能力,以此衡量神经功能的变化,结果显示,给予PERK抑制剂的果蝇eIF2α磷酸化水平相较于未给药的对照组降低了63%,攀爬能力提升了24%(均P<0.01);选用原代大鼠皮质神经元进行体外培养,并转染TDP-43相关质粒,给予不同浓度的PERK抑制剂,通过显微镜观察神经元死亡情况,结果显示,与未给药的对照组相比,给予浓度为1μmol/L及以上的PERK抑制剂对神经元具有损害作用,而给予浓度为50nmol/L和500nmol/L的PERK抑制剂可减轻TDP-43对原代神经元的毒性(均P<0.01)｡尽管PERK抑制剂可降低eIF2α磷酸化水平,缓解神经毒性,但其对全局蛋白质翻译的潜在影响以及在哺乳动物体内的神经毒性特征仍存在不确定性,尚需进一步的观察研究｡

多核糖体解离导致局部RNA浓度升高,脱离核糖体的mRNA可被易于聚集的mRNA结合蛋白或错误折叠蛋白接触,从而诱导应激颗粒形成｡基于此机制,Novac等采用克雷布斯腹水细胞制备的体外翻译提取物作为实验模型,模拟细胞内的翻译环境,构建包含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因的双顺反子mRNA,将依米汀(翻译延伸抑制剂)和放线菌酮(肽基转移酶抑制剂)分别添加至含有上述mRNA的体外翻译提取物中,通过检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性并对翻译产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,以间接反映mRNA的翻译情况,结果显示,相较于未给药的对照组,给药组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达量均降低,翻译产物条带均减弱,表明给药组的翻译效率下降,蛋白产物生成减少,提示mRNA的翻译过程受到抑制,其可能与mRNA被锚定在多核糖体复合物中,无法正常进行翻译过程有关｡通过对mRNA分布的调控,可减少细胞质中游离mRNA的积累,有效阻断应激颗粒组装所需的关键原料供给,或可成为抑制病理性应激颗粒形成的关键步骤｡

应激颗粒在IS病程中具有双重调控作用:IS再灌注后超早期通过液-液相分离形成的可逆性动态应激颗粒可抑制神经元凋亡,而IS再灌注后急性期液-固相变产生的病理性应激颗粒则可通过干扰RNA稳态及抑制核质转运引发神经功能障碍｡这种动态相变过程受RBP翻译后修饰､分子伴侣功能及细胞微环境等多维度调控,这为IS全病程干预提供了新的靶点｡基于应激颗粒的IS再灌注后超早期神经保护策略已有相关研究报道,但目前针对IS再灌注后急性期病理性应激颗粒持续积累所致神经功能障碍具有明确疗效的干预策略相对匮乏｡此外,在IS再灌注后超早期促进动态应激颗粒形成以发挥神经保护作用,而在IS再灌注后急性期抑制病理性应激颗粒液-固相变以防止神经毒性,这种双向调控的时间窗界定与干预策略优化仍需深入研究｡